大鼠不同程度腦損傷模型

大鼠不同程度腦損傷模型

(1)復制方法  健康雄性大鼠，體重為230～260g。采用改進的Feeney自由落體硬膜外撞擊方法。損傷裝置由底板、固定支架、垂直導桿、下落和聚乙烯撞擊圓錐組成。撞擊圓錐頭端直徑為4mm、高為2.5mm。經腹腔注射水合氯醛(按350～400mg/kg體重的劑量)或戊丨巴丨比丨妥丨鈉(按50～60mg/kg體重的劑量)麻醉。將其頭部固定于立體定向儀上，剪去頂部毛發，手術區域皮膚消毒。沿中線左側切開頭皮，分離骨膜，用牙科鉆于中線旁2mm、緊挨冠狀縫后開一直徑5mm的圓形窗，硬膜保持完整。用20g砝碼于10cm和30cm高處通過一金屬導桿墜落，撞擊置于硬膜上的圓錐上致輕、中型損傷，另用40g砝碼于25cm高處墜落致重型損傷。輕、中、重三型損傷的致傷沖擊力分別為200g·cm、600g·cm和1000g·cm，用鋅汀粉封閉骨窗，縫合頭皮，置鼠籠喂養。

(2)檢測指標

1)腦含水量測定  動物斷頭處死后，30s內取出大腦，用濾紙吸盡腦表面血丨漬后，銳性分離左側頂葉皮質約100mg，用電子分析天平稱濕重后，置于110℃恒溫干燥箱內烤干(24h)，稱干重。用Elliot公式計算各部位腦含水量百分率：

腦含水量(％)＝[(濕重－干重)/濕重]×比率

2)血腦屏障定量測定  動物于損傷前1h注射2％伊文斯藍(3ml/kg體重)。在取腦組織前，為清除血液中染料，可用生理鹽水經左心室灌注至右心室流出清亮液體為止。取損傷側皮質分別稱重，加入二倍體積的二甲基甲酰胺，50℃水浴中孵育72h，1500g離心，離心10min，取上清液。應用分光光度計在伊文斯藍大吸收光譜635mm處檢測吸光度，從標準曲線上查得伊文斯藍含量，結果以μg/g腦組織表示。

3)病理學觀察  損傷后24h再次麻醉，經升主動脈快速灌注生理鹽水150ml，繼之快速灌注冰冷的4％多聚甲醛200ml，隨后再用其300ml在2h內慢速灌注，取腦組織浸入4％多聚甲醛內4℃后固定48h，常規乙醇脫水，石蠟包埋，行5μm冠狀切片，作HE染色及尼氏小體染色，光鏡下觀察。若采用透射電鏡觀察者，灌注液為4％多聚甲醛和2％戊二醛/0.1MPB(pH7.4)，隨后浸入2％戊二醛/0.1MPB(pH7.4)內，4℃固定過夜。常規脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛鈾染色，透射電鏡觀察。

(3)模型特點

1)腦含水量變化  輕型腦損傷傷后30min，傷側腦皮質含水量開始升高，3h顯著升高，24h達高峰，為80％左右。72h含水量有所降低，至損傷后168h腦含水量恢復正常。中型腦損傷傷后15min，傷側皮質含水量即已升高，30min顯著升高，6h達高峰，也為80％左右，持續至24h。至168h含水量基本恢復正常。重型腦損傷傷后其傷側皮質含水量于傷后15min明顯升高，傷后3～6h達高峰，持續至72h。傷后168h腦含水量仍高于正常對照值。

2)血腦屏障定量測定  腦損傷后血腦屏障通透性明顯增高，并隨損傷程度的加重而加重。在損傷15min后，損傷側皮質伊文斯藍含量就明顯增高，輕、中型于6h達高峰，重型者3h達高峰，24h開始下降。

3)組織學和超微結構改變

①光鏡觀察  輕型損傷后24h光鏡觀察，見神經細胞周圍出現水腫，尼氏小體染色變淺，微血管外間隙擴大；中型損傷后24h，神經細胞周圍水腫，微血管外間隙增大更為明顯；重型損傷后24h，皮質神經細胞周圍水腫明顯，尼氏小體染色明顯變淺，微血管內皮細胞腫脹，管腔狹窄更加明顯。

②透射電鏡觀察  輕型損傷傷后24h，傷側皮質神經細胞線粒體明顯腫脹，內質網輕度擴張。神經細胞周圍神經氈腫脹，微血管內皮細胞胞飲小泡增多、腫脹、管腔狹窄。膠質細胞出現水腫改變，特征同神經細胞，但改變較輕微；中型損傷后24h神經細胞線粒體及神經氈空泡樣變，微血管內皮細胞腫脹及管腔狹窄明顯；重型損傷傷后24h，絕大部分神經細胞及膠質細胞內可見到空泡樣變的少數線粒體及高度擴張的內質網。細胞核染色質邊聚，染色變淡，核膜皺縮。神經氈空泡樣變。微血管內皮細胞腫脹更加明顯，胞飲增多，管腔明顯狹窄。

(4)比較醫學  此模型為自由落體腦損傷，屬機械性損傷，類似臨床上的加速傷。由于損傷部位局限，所造成的局部腦損傷性質與臨床上見到的腦挫裂傷相似。該模型具有以下優點：①損傷機制單一便于定性研究。②方法簡單，條件易于控制，采用自由落體打擊法，可根據需要控制高度和重量。③致傷程度較一致，重復性好。④腦水腫性質與臨床上創傷性腦水腫相似，定量準確。⑤實驗對象采用大鼠，價廉、抗病、便于大批定量研究和長時間觀察。

此方法也可采用小鼠和新西蘭白兔。小鼠：將小鼠固定在自由落體腦損傷裝置的底部平臺上，用直徑約4mm的撞頂在小鼠顱骨矢狀面左側2～4mm處，取50g砝碼，從15cm高處自由落下，通過撞造成閉合性腦外傷模型動物。兔子：于頭頂部正中矢狀位切開至顱骨表面，分離兩旁軟組織，微型鉆頭在右頂骨上四點鉆孔。線鋸鋸開骨橋，在右頂骨上形成直徑為1.5cm×1.5cm的方形骨窗。置入打擊墊于硬膜外，用800g·cm的打擊能量使腦組織造成挫裂傷。還納骨瓣，骨縫用醫用EC膠封閉，縫合頭皮。