- 樣品準備
將不同分組的細胞從培養箱中取出（每組2個10cm的皿），在冰上用預冷的PBS洗一遍，加入裂解液（20mM Tris-HCL Ph7.5、150 mM Nacl、1%TritonX-100、1 mM EDTA和蛋白酶抑制劑），用細胞刮裂解細胞。13000rpm 4℃離心10min，去上清進行蛋白定量。定量后原液備用。
- 蛋白定量
1 標準曲線的繪制：取一塊酶標板，按照下表加入試劑
孔號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
蛋白標準液（μl） | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 12 | 16 | 20 |
去離子水（μl） | 20 | 18 | 16 | 14 | 12 | 8 | 4 | 0 |
蛋白濃度（μg/μl） | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
2. 根據樣品數量，將BCA試劑A與試劑B按體積比為50:1配制適量BCA工作液，充分混勻；
3. 各孔加入160μl BCA工作液；
4. 把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測定吸光度。以吸光值為橫坐標，蛋白濃度（μg/μl）為縱坐標，繪出標準曲線；
5. 在酶標板中加入2μl待測蛋白和18μl PBS（稀釋10倍），加入160μl BCA工作液，把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測定吸光度。
6. 根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白濃度（μg/μl），乘以樣品稀釋倍數（10）即為樣品實際濃度（單位：μg /μl）。
- 共沉淀
- 根據蛋白定量結果，將各組蛋白留取適量用于做input對照；
- 分別取各組細胞蛋白置于2個1.5ml離心管中（2mg每管），其中一個加入2ug IgG，另外一個加入2ug IP指標對應的抗體，冰上孵育2h；
- 分別向兩個管子中加入protein G-Agarose beads（Roche），加裂解液至1ml。4℃旋轉混勻，孵育過夜；
- 2500rpm，4℃離心1min，去上清，1ml裂解液洗滌沉淀4次；
- 加入2×蛋白上樣緩沖液，輕輕混勻后煮沸5min，2500rpm離心1min，棄沉淀；
- 將上清轉移至新的離心管中，用于western blot檢測相應蛋白。
- PAGE膠的制備
1. 下層分離膠的制備
根據目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度，高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離。 GRα 90kDa AP-1 43.48kDa IkB 39kDa STAT3 79， 86kDa NF-KB p65 故選用10%的膠。不同濃度的分離膠按下表進行配制，待下層膠凝固后進行上次濃縮膠的配制。
2. 上層濃縮膠的配制
根據需要按下表配制濃縮膠，并插好梳子。
- 上樣及電泳
1. 上樣
每孔上樣量約為20ul蛋白，可以根據實驗要求加大上樣量。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，取下梳子用槍輕輕吹打加樣孔，避免孔內有余膠殘留影響上樣。將準備好的樣品用加樣槍慢慢加到對應的孔內，注意勿溢出加樣孔。
2. 電泳
一般濃縮膠80V 20分鐘，分離膠120V 60分鐘，可以根據具體實驗要求調整電壓和時間。當染料到達膠底部時切斷電源，停止電泳，進行下一步轉膜。
- 轉膜
轉膜分為濕轉和半干轉，本實驗室選用半干轉。
半干式轉膜中，三明治的排列為：/慮紙/膠/膜/慮紙，用電轉緩沖液浸濕后，直接置于電轉儀的正負極之間。膠于負極而膜置于正極。半干式的電轉緩沖液不同于濕式的電轉緩沖液，推薦為：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V轉膜30分鐘即可。轉膜前將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分鐘（NC膜在電轉液中浸泡10-20分鐘），再孵育于冰冷的電轉緩沖液中5 分鐘，膠也需在冰冷的電轉緩沖液中平衡3-5 分鐘，否則轉膜時會導致條帶變形。
- 膜上蛋白的檢測
為檢測轉膜是否成功，可用麗春紅染色，麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：10 稀釋，即加9 倍的ddH2O
染色方法：將膜放入TBST 洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下搖動染色5 分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST 或水重新洗后再進行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進行封閉。
- 膜的封閉及抗體孵育
1. 封閉：5%脫脂奶粉（檢測磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1小時或4℃過夜。
2. 一抗：根據說明書GRα 1:800 AP-1 1:1000 IkB 1:1000 STAT3 1:1000 NF-KB 1：1000 稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2小時或4 ℃孵育過夜。
3. 二抗：孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5min。隨后根據用量，按照1:1000稀釋HRP標記的二抗，與膜37℃孵育1h。用TBST洗滌3次，每次5min。
- 顯色
ECL化學發光檢測：配制ECL發光液，根據用量，取ECL發光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5分鐘。倒掉顯色液，用紙小心吸取顯色液，在上面蓋上一層平整的透明紙。將其放入成像系統中進行掃描?？梢愿鶕l帶強弱再次感光或減短感光時間已達到理想結果。
